Specyficzność gatunkowa tocilizumabu: kluczowy aspekt w badaniach i terapii

Jak działa IL-6 i dlaczego gatunkowość ma znaczenie?

Interleukin-6 (IL-6) to wielofunkcyjna cytokina odgrywająca kluczową rolę zarówno w utrzymaniu homeostazy organizmu, jak i w przebiegu chorób zapalnych. Stężenie IL-6 w surowicy zdrowych osób jest niskie, jednak gwałtownie wzrasta w niemal wszystkich chorobach o podłożu zapalnym. Z tego powodu już ponad 20 lat temu IL-6 została zidentyfikowana jako odpowiedni cel terapeutyczny. Od tamtej pory opracowano szereg przeciwciał, białek projektowanych oraz małocząsteczkowych związków ukierunkowanych na poszczególne białka osi sygnalizacyjnej IL-6/gp130/STAT3, których zadaniem jest hamowanie przekazywania sygnałów zależnych od IL-6. Pierwszym zatwierdzonym przeciwciałem był tocilizumab – humanizowane przeciwciało monoklonalne, które wiąże się z receptorem IL-6 (IL-6R), uniemożliwiając przyłączenie IL-6 i tym samym inicjację całej kaskady sygnalizacyjnej.

W przeciwieństwie do wielu innych cytokin, IL-6 wykazuje właściwości gatunkowo specyficzne. Ludzka IL-6 może wiązać się zarówno z ludzkim, jak i mysim receptorem IL-6R, podczas gdy mysia IL-6 wiąże się oczywiście z mysim IL-6R, ale nie wykazuje powinowactwa do ludzkiego IL-6R. Zjawisko to można wyjaśnić istotnymi różnicami strukturalnymi pomiędzy ludzkim i mysim IL-6R oraz faktem, że tzw. miejsce I (site I), które odpowiada za bezpośrednią interakcję między IL-6 a IL-6R, nie jest zachowane ewolucyjnie między ludzkim i mysim receptorem. W konsekwencji, liczne badania wykazały, że tocilizumab nie jest w stanie blokować sygnalizacji IL-6 poprzez mysi czy szczurzy IL-6R. “Nasze wyniki jednoznacznie potwierdzają, że tocilizumab nie wykazuje aktywności hamującej wobec mysiego receptora IL-6, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami” – piszą autorzy jednego z badań potwierdzających tę obserwację.

Jak wyjaśnić sprzeczne wyniki badań przedklinicznych?

Fakt ten ma istotne konsekwencje dla badań przedklinicznych. Badania na gryzoniach, wymagane do zatwierdzenia tocilizumabu do stosowania u pacjentów, nie mogły być przeprowadzone z użyciem samego tocilizumabu. Zamiast tego musiały zostać wykonane z wykorzystaniem przeciwciała zastępczego o nazwie MR16-1, które blokuje mysi i szczurzy IL-6R. Analiza działania tocilizumabu na myszach jest możliwa jedynie w genetycznie zmodyfikowanych modelach, w których endogenny locus genu kodującego mysi IL-6R został zastąpiony ludzkim genem IL6R. Czy zatem możliwe jest, aby tocilizumab wykazywał efekt terapeutyczny w modelach mysich czy szczurzych bez takiej modyfikacji genetycznej? Dostępne dane naukowe wskazują, że nie.

W tym kontekście zaskakująca jest niedawna publikacja Wenga i współpracowników w czasopiśmie Naunyn–Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, opisująca paradoksalne efekty tocilizumabu w ostrym uszkodzeniu płuc wywołanym lipopolisacharydem (LPS) zarówno w badaniach in vitro na mysiej linii komórkowej, jak i in vivo na modelu szczurzym. Jak wyjaśniono powyżej, zgromadzone dowody naukowe jednoznacznie wskazują, że tocilizumab nie może wiązać się z IL-6R obecnym na mysich komórkach ani z IL-6R obecnym u szczurów. Co ciekawe, autorzy nie przedstawiają żadnych danych sprzecznych z tą wiedzą, które pokazywałyby, że tocilizumab jest rzeczywiście skuteczny u szczurów lub na mysich komórkach. Rodzi to fundamentalne pytanie: skąd pochodzą obserwowane przez autorów efekty, skoro nie mogą one wynikać z udanego zahamowania sygnalizacji IL-6?

Oprócz tego podstawowego problemu, praca Wenga i współpracowników przedstawia inne wyniki, które są niezgodne z obecną wiedzą na temat biologii IL-6. Autorzy wywołują ostre uszkodzenie płuc poprzez wstrzyknięcie LPS, znanego aktywatora transkrypcji genów zależnej od NF-κB, co prowadzi do indukcji cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, TNFα i IL-6, co zostało pokazane na rycinie 4 ich manuskryptu. Zaskakująco, autorzy donoszą o dezaktywacji sygnalizacji PI3K/Akt, co wykazano poprzez zmniejszoną fosforylację PI3K i Akt na rycinie 1 ich manuskryptu. Jak wspomniano wcześniej, IL-6 aktywuje sygnalizację PI3K/Akt po związaniu z IL-6R, co powinno skutkować zwiększoną, a nie zmniejszoną fosforylacją PI3K i Akt. Czy możliwe jest, aby mechanizm działania był zupełnie odwrotny niż ten dobrze udokumentowany w literaturze?

Podobny problem pojawia się na rycinie 2 publikacji Wenga, która przedstawia zasadniczo te same obserwacje w mysiej linii komórkowej in vitro. Jednak stymulacja komórek LPS powinna prowadzić do bezpośredniej aktywacji sygnalizacji PI3K/Akt nawet bez udziału IL-6 i innych cytokin, co wykazano ponad dwie dekady temu. Raportowane zmniejszenie pAkt i pPI3K jest zatem mało wiarygodne, a kwestia dlaczego blokada IL-6R miałaby wpływać na sygnalizację zależną od LPS, która jest wykrywana przez TLR4, a nie IL-6R, pozostaje niejasna. Czy możliwe jest, aby tocilizumab oddziaływał na inne receptory niż IL-6R? Literatura naukowa nie dostarcza dowodów na takie niespecyficzne działanie.

Czy tocilizumab działa zgodnie z oczekiwaniami?

Kolejnym punktem budzącym wątpliwości są raportowane poziomy IL-6 w płucach zwierząt, które są znacząco wyższe u zwierząt otrzymujących tocilizumab w połączeniu z inhibitorem ERK LY294002 w porównaniu do zwierząt leczonych wyłącznie tocilizumabem (Ryc. 4C w publikacji Wenga i wsp.). IL-6 jest usuwana z krążenia poprzez wiązanie z IL-6R i następującą po tym internalizację kompleksu sygnalizacyjnego IL-6/IL-6R/gp130. Blokada IL-6R przez tocilizumab zapobiegałaby temu procesowi, i rzeczywiście, u pacjentów leczonych tocilizumabem obserwuje się zwiększone poziomy IL-6 w krążeniu z powodu braku pobierania IL-6 do tkanek. Jeśli IL-6R u szczurów byłby skutecznie blokowany przez tocilizumab, należałoby oczekiwać podobnych poziomów IL-6 w płucach obu grup zwierząt, ponieważ hamowanie ERK nie odgrywa roli w wiązaniu IL-6 do IL-6R. Raportowane różnice w pracy Wenga i wsp. podkreślają, że tocilizumab nie działa zgodnie z zamierzeniem po wstrzyknięciu szczurom.

W dyskusji autorzy argumentują, że zmniejszenie poziomów cytokin w płucach świadczy o przeciwzapalnym potencjale tocilizumabu i że “poprzez hamowanie sygnalizacji IL-6, [tocilizumab] skutecznie zmniejszył poziomy cytokin prozapalnych”. Jest to fundamentalne niezrozumienie biologii IL-6. Produkcja i uwalnianie IL-6 po bodźcu zapalnym (w tym przypadku LPS) nie ma nic wspólnego z biologiczną funkcją IL-6 po związaniu z IL-6R na komórkach docelowych. LPS wiąże się z TLR4, a aktywowany czynnik transkrypcyjny NF-kB prowadzi do transkrypcji mRNA IL-6 (i innych cytokin prozapalnych, jak TNFα), co następnie skutkuje produkcją białka IL-6 i jego uwolnieniem z komórki do przestrzeni pozakomórkowej. Ta produkcja cytokin nie wymaga IL-6R na żadnym etapie i może być wykonywana przez dowolny typ komórek organizmu, niezależnie od tego, czy wyraża IL-6R na swojej powierzchni, czy nie.

Tocilizumab w ogóle nie ingeruje w ten proces – tocilizumab blokuje jedynie wiązanie IL-6 na komórkach ekspresjonujących IL-6R, hamując tym samym jego funkcje biologiczne, ale nie początkową produkcję IL-6. Zmniejszone poziomy cytokin nie są zatem wskaźnikiem skutecznego hamowania IL-6R; przeciwnie, zwiększone poziomy IL-6 w surowicy leczonych zwierząt (które nie są raportowane w pracy Wenga i wsp.), obserwowane u leczonych pacjentów, byłyby wskaźnikiem blokowania IL-6R przez tocilizumab. Jak więc wytłumaczyć obserwowane przez autorów efekty? Czy możliwe są inne mechanizmy działania tocilizumabu, nieznane dotychczas nauce?

Nie jest to jedyna osobliwość w sekcji dyskusji, ponieważ autorzy później twierdzą, że “aktywacja receptora IL-6 może hamować wewnątrzkomórkowy szlak sygnalizacyjny PI3K/Akt”, cytując dwie publikacje jako dowód tego twierdzenia. Jednak Sun i wsp. (2020) nie przedstawiają w swojej pracy żadnych danych pokazujących, że aktywacja IL-6R może hamować sygnalizację PI3K/Akt, a praca Patruno i wsp. (2012) nawet nie wspomina o IL-6 czy IL-6R. Autorzy nie przedstawiają zatem żadnych dowodów na swoje twierdzenie, że aktywacja IL-6R hamuje sygnalizację PI3K/Akt, a jak opisano powyżej, prawdziwe jest dokładnie przeciwieństwo.

Jak bezpiecznie stosować tocilizumab w praktyce klinicznej?

Podsumowując, efekty tocilizumabu raportowane w pracy Wenga i wsp. nie są wiarygodne, są bezpośrednio sprzeczne z tym, co zostało opublikowane przez kilka innych grup w ciągu ostatnich dwóch dekad, i nie są zgodne z tym, co wiadomo o biologii IL-6. Jak pokazano w tabeli porównawczej w oryginalnym artykule, istnieje szereg rozbieżności między twierdzeniami Wenga i współpracowników a ustaloną wiedzą naukową. Tocilizumab jest nieaktywny na mysich komórkach i u szczurów, podczas gdy autorzy twierdzą przeciwnie. IL-6 aktywuje, a nie dezaktywuje szlak PI3K/Akt, a tocilizumab powinien dezaktywować, a nie aktywować ten szlak. Poziomy płucne IL-6 powinny być niezależne od inhibitora ERK, a po zablokowaniu IL-6R powinny być zmniejszone, a nie zwiększone.

Dla lekarzy stosujących tocilizumab w praktyce klinicznej kluczowe jest zrozumienie jego rzeczywistego mechanizmu działania oraz ograniczeń badań przedklinicznych prowadzonych na modelach zwierzęcych. Tocilizumab pozostaje skutecznym narzędziem terapeutycznym w leczeniu chorób zapalnych u ludzi, gdzie wykazuje swoje działanie poprzez blokowanie ludzkiego IL-6R. Jednak jego stosowanie w badaniach na modelach zwierzęcych wymaga ostrożności i świadomości gatunkowej specyficzności IL-6 i jej receptora.

Warto również podkreślić znaczenie prawidłowego projektowania badań przedklinicznych z wykorzystaniem odpowiednich modeli zwierzęcych, które uwzględniają gatunkową specyficzność badanych cząsteczek. W przypadku tocilizumabu właściwym podejściem jest stosowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy z ludzkim genem IL6R lub wykorzystanie przeciwciał zastępczych, takich jak MR16-1, które skutecznie blokują mysi i szczurzy IL-6R.

Dla badaczy i klinicystów ważne jest krytyczne podejście do wyników badań, szczególnie gdy są one sprzeczne z ustaloną wiedzą naukową. Przypadek opisany w niniejszym artykule podkreśla znaczenie dokładnego zrozumienia mechanizmów działania leków biologicznych oraz konieczność ostrożnej interpretacji wyników badań przedklinicznych przy ekstrapolowaniu ich na zastosowania kliniczne u ludzi.

Podsumowanie

Interleukin-6 (IL-6) to kluczowa cytokina w procesach zapalnych, której blokowanie stanowi cel terapeutyczny. Tocilizumab, humanizowane przeciwciało monoklonalne, jest skutecznym inhibitorem ludzkiego receptora IL-6 (IL-6R), jednak wykazuje istotną specyficzność gatunkową. Ludzka IL-6 może oddziaływać zarówno z ludzkim jak i mysim IL-6R, podczas gdy mysia IL-6 wiąże się wyłącznie z mysim receptorem. W konsekwencji, tocilizumab nie wykazuje aktywności wobec mysiego czy szczurzego IL-6R, co ma fundamentalne znaczenie dla badań przedklinicznych. Niedawna publikacja Wenga i współpracowników, raportująca efekty tocilizumabu w modelach zwierzęcych, prezentuje wyniki sprzeczne z obecną wiedzą naukową dotyczącą mechanizmu działania tego leku. Dla bezpiecznego stosowania tocilizumabu w praktyce klinicznej kluczowe jest zrozumienie jego rzeczywistego mechanizmu działania oraz ograniczeń badań na modelach zwierzęcych.