Nanoplatforma LPC-TCZ w terapii opornego na cisplatynę raka płuca

Jakie mechanizmy prowadzą do oporności na cisplatynę?

Rak płuca pozostaje jednym z wiodących kryzysów zdrowotnych na świecie, zajmując drugie miejsce pod względem śmiertelności związanej z nowotworami, z szacowaną liczbą 2,2 miliona nowych przypadków rocznie. Patogeneza tego nowotworu jest nieodłącznie związana z ekspozycją na tytoń (odpowiedzialną za 85% przypadków), karcynogeny środowiskowe i zagrożenia zawodowe. Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC), stanowiący 85% nowotworów płuc, manifestuje się jako histologicznie odrębne podtypy, w tym gruczolakorak, rak płaskonabłonkowy i rak wielkokomórkowy. Pomimo postępów terapeutycznych, ponad 70% pacjentów z NSCLC prezentuje miejscowo zaawansowaną lub przerzutową chorobę w momencie diagnozy, co skutkuje 5-letnimi wskaźnikami przeżycia poniżej 15%. Schematy chemioterapii oparte na platynie, łączące cisplatynę (cis-diaminodichloroplatyna II—CDDP) z taksanami lub alkaloidami vinca, pozostają pierwszą linią terapii systemowej, choć ich użyteczność kliniczna jest poważnie ograniczona przez dwa fundamentalne ograniczenia.

CDDP wywiera efekty cytotoksyczne poprzez tworzenie wiązań krzyżowych DNA, zakłócając mechanizmy replikacji i transkrypcji; jednakże, jej nieselektywna biodystrybucja powoduje ograniczającą dawkę nefrotoksyczność, neurotoksyczność i mielosupresję. Podczas gdy systemy dostarczania leków oparte na nanocząstkach pojawiły się, aby zwiększyć akumulację w guzie i zmniejszyć toksyczność poza celem, bardziej podstępne wyzwanie utrzymuje się — nabyta chemooporność. Przewlekła ekspozycja na CDDP indukuje przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) i wzbogaca populacje komórek macierzystych raka (CSC) poprzez szlaki zależne od STAT3, tworząc guzy oporne na leczenie ze zwiększonym potencjałem przerzutowym. Ta biologiczna transformacja ustanawia samowzmacniający się cykl niepowodzenia terapeutycznego, wymagający innowacyjnych strategii, aby jednocześnie przezwyciężyć chemooporność i przerzuty.

Oś sygnałowa interleukiny 6 (IL-6) została niedawno wskazana jako główny regulator tej złośliwej progresji. W mikrośrodowisku guza (TME), komórki zrębu i złośliwe klony wydzielają IL-6, która aktywuje kaskady gp130/JAK/STAT3 poprzez wiązanie z receptorem IL-6 (IL-6R). Ten szlak orchestruje chemooporność poprzez regulację w górę markerów EMT (N-kadheryna, Twist i Snail), jednocześnie tłumiąc E-kadherynę i zwiększając plastyczność CSC poprzez nadekspresję Oct-4/Sox-2/Nanog. Dowody przedkliniczne potwierdzają, że inhibicja szlaku IL-6 ponownie uwrażliwia guzy na CDDP, jednak translacja kliniczna wymaga precyzyjnej kontroli przestrzennej blokady IL-6R w obrębie TME. Tocilizumab (TCZ), humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-IL-6R, które zostało klinicznie zatwierdzone do leczenia zaburzeń autoimmunologicznych, wykazuje pojawiającą się aktywność przeciwnowotworową w wielu nowotworach złośliwych. Podczas gdy poprzednie formulacje nanoskopowe TCZ koncentrowały się na leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów poprzez pasywną adsorpcję, żadne badania nie wykorzystały potencjału TCZ w celowaniu na nowotwory poprzez koniugację kowalencyjną ani nie badały jego synergii z chemioterapeutykami.

Czy innowacyjna nanoarchitektura pokonuje oporność?

W niniejszym artykule przedstawiamy racjonalnie zaprojektowany nanopęcherzyk cisplatyny pokryty lipidami (LPC) funkcjonalizowany specyficzną dla miejsca koniugacją TCZ (LPC-TCZ) przy użyciu chemii EDC/NHS. Ta nowatorska nanoarchitektura zapewnia cztery kluczowe postępy. Po pierwsze, dwuwarstwa lipidowa zwiększa rozpuszczalność CDDP, umożliwiając jednocześnie kontrolę orientacji TCZ dla optymalnego zaangażowania receptora. Po drugie, aktywne celowanie za pośrednictwem TCZ synergizuje z efektami zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) dla selektywnej akumulacji w guzie. Po trzecie, lokalna blokada IL-6R zakłóca fosforylację STAT3, odwracając fenotypy EMT i CSC w celu ponownego uwrażliwienia guzów. Po czwarte, czasoprzestrzenna koordynacja uwalniania CDDP i inhibicji szlaku tworzy samowzmacniający się cykl terapeutyczny.

Synteza LPC-TCZ została przeprowadzona w kilku etapach. Najpierw przygotowano rdzeń LPC przy użyciu metody mikroemulsji odwróconej fazy, a następnie zastosowano metodę hydratacji cienkiego filmu do uzyskania LPC. W ostatnim etapie, TCZ został koniugowany z powierzchnią nanocząstek za pomocą metody EDC/NHS. Obrazy TEM rdzenia LPC i nanocząstek LPC-TCZ pokazują jednolitą sferyczną formę z wyraźną warstwą fosfolipidową na powierzchni zewnętrznej. Skuteczne enkapsulowanie cisplatyny w nanocząstkach zostało potwierdzone przez równomierną dystrybucję pierwiastków platyny i chloru wewnątrz rdzenia LPC, ujawnioną przez mapowanie pierwiastków. LPC i LPC-TCZ miały średnią średnicę cząstek odpowiednio 317,77 ± 18,09 nm i 318,63 ± 12,85 nm, określoną za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Potencjał zeta i indeks polidyspersyjności LPC wynosiły -8,58 ± 0,28 mV i 0,219 ± 0,036, podczas gdy dla LPC-TCZ NPs były to -6,36 ± 0,88 mV i 0,221 ± 0,019, co wskazuje na dobrą dyspersję nanocząstek. Wydajność enkapsulacji CDDP i efektywność sprzężenia TCZ wynosiły odpowiednio 31,13% i 66,17%. Uwalnianie CDDP z nanocząstek LPC-TCZ było powolne, z mniej niż 50% CDDP uwolnionego po 48 godzinach, co wskazuje na długoterminową stabilność cykliczną LPC-TCZ.

Jakie efekty in vitro osiągają nanocząstki LPC-TCZ?

Badania in vitro wykazały, że komórki A549/CDDP wykazywały zmniejszony wychwyt cisplatyny i LPC; jednakże efekt ten został zniwelowany po zastosowaniu LPC-TCZ. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że LPC-TCZ miał znacznie wyższą intensywność fluorescencji niż LPC, wskazując na dobrą zdolność aktywnego celowania LPC-TCZ. Zielona fluorescencja pojawiła się w prawie wszystkich komórkach po 0,5 godziny, co sugeruje, że LPC-TCZ może być szybko pobierany przez komórki nowotworowe. Następnie intensywność fluorescencji w komórkach nowotworowych stopniowo wzrastała, osiągając maksimum po 12 godzinach.

Aby zweryfikować, że TCZ może odwrócić oporność na CDDP, przeprowadzono test MTT na komórkach A549/CDDP. W zakresie stężeń 0,01–1 μM, TCZ miał prawie zerowy efekt zabijający na komórki nowotworowe. Skuteczność cytotoksyczna LPC na komórki A549/CDDP przewyższa tę wolnej cisplatyny, gdy podawana jest w równoważnych stężeniach. Gdy stężenie CDDP wynosiło 75 μM, żywotność komórek nanocząstek LPC-TCZ była o 4,67% niższa niż LPC, a gdy stężenie CDDP wynosiło 100 μM, żywotność komórek nanocząstek LPC-TCZ była o 6,86% niższa niż LPC. Wyniki te sugerują, że TCZ może zwiększać wrażliwość komórek nowotworowych na CDDP.

Przeprowadzono test gojenia ran, aby zbadać działanie przeciwprzerzutowe nanocząstek LPC-TCZ. Zarówno CDDP, jak i TCZ wykazały zdolność do hamowania ruchliwości komórek. Jednakże, silniejsze hamowanie gojenia ran zaobserwowano w grupach zawierających TCZ w porównaniu do CDDP. Wskaźniki migracji komórek wynosiły 27,36% i 12,71% odpowiednio dla grupy LPC i grupy LPC-TCZ, wskazując na znacznie zwiększone hamowanie migracji komórek przez nanocząstki sprzężone z TCZ. Ponadto oceniono hamujący wpływ nanocząstek LPC-TCZ na wzrost wielokomórkowych sferoidów nowotworowych (MCTS). LPC wykazały minimalny wpływ na wzrost MCTS, prawdopodobnie z powodu niewystarczającego uwalniania i penetracji leku. W dniu 3, objętość MCTS w grupie LPC wzrosła do 146%, podczas gdy objętość MCTS w grupie LPC-TCZ wzrosła tylko do 119%, wskazując, że TCZ może skutecznie zwiększać hamujący wpływ CDDP na wzrost MCTS.

Czy leczenie przekłada się na zmianę markerów EMT i CSC?

Analiza Western blot wykazała, że poziomy JAK1 i STAT3 nie wykazały znaczących zmian po inkubacji komórek A549/CDDP z poszczególnymi składnikami. Jednak ekspresja p-JAK1 i p-STAT3 zmniejszyła się zarówno w grupie wolnego TCZ, jak i nanocząstek LPC-TCZ, wskazując, że TCZ może hamować fosforylację JAK1 i STAT3. Zmierzono również ekspresję białek związanych z EMT. Wolny CDDP i LPC miały minimalny wpływ regulacyjny na białka związane z EMT, podczas gdy wolny TCZ i nanocząstki LPC-TCZ regulowały w górę poziomy E-kadheryny i w dół ekspresję N-kadheryny, wimentyny i Snail, ilustrując, że TCZ może odwrócić proces EMT.

Hamowanie ekspresji markerów komórek macierzystych guza może zmniejszyć liczbę populacji komórek macierzystych w guzach i zwiększyć wrażliwość guza na CDDP, tym samym odwracając oporność na leki. Testy Western blot wykazały, że TCZ hamował ekspresję markerów komórek macierzystych guza Oct-4, Sox-2 i Nanog, wyjaśniając tym samym mechanizm zdolności TCZ do zwiększania skuteczności CDDP w teście MTT i teście hamowania kuli komórek macierzystych guza.

Jak nanocząstki działają w modelach in vivo?

Badano dystrybucję leku w mysim modelu ksenoprzeszczepu A549/CDDP, wykorzystując znakowane biotyną LPC-TCZ i monitorując jego dystrybucję w tkankach guza w różnych odstępach czasu. Wyniki wskazały, że po podaniu LPC-TCZ przez żyłę ogonową, intensywność fluorescencji osiągnęła maksimum, sugerując, że LPC-TCZ krążył w organizmie przez 8 godzin przed rozpoczęciem akumulacji w miejscu guza. Następnie zbadano, jak cisplatyna była dystrybuowana po wstrzyknięciu LPC-TCZ. Wyniki eksperymentalne wykazały, że Pt wykazała znaczną akumulację w tkankach guza w ciągu 8 godzin po podaniu, z utrzymującymi się wysokimi stężeniami Pt utrzymującymi się w miejscach guza nawet po 24 godzinach.

Efekt przeciwnowotworowy in vivo nanocząstek LPC-TCZ oceniono przy użyciu modelu ksenoprzeszczepu A549/CDDP. Farmakologiczna interwencja rozpoczęła się czterema dawkami, gdy objętość guza osiągnęła wielkość 50–100 mm³. W ostatnim dniu badania myszy zostały uśmiercone, a próbki guza zebrane do analizy. Objętość guza osiągnęła około 200 mm³ u nagich myszy BALB/c 12 dni po wszczepieniu guza. Różne leki podawano przez żyłę ogonową w dniach 12, 15, 19 i 22.

Guzy w grupie PBS były największe w dniu 30, ze średnią wagą 579,16 mg. TCZ, cisplatyna i nanocząstki LPC hamowały wzrost guza. Średnia waga guza w grupie nanocząstek LPC-TCZ była najniższa, wynosząc 344,00 mg. Odpowiednio, nanocząstki LPC-TCZ miały najlepszy efekt hamujący guz, ze wskaźnikiem hamowania guza wynoszącym 40,60%, sugerując, że TCZ mógł zwiększyć toksyczność cisplatyny dla guzów. Masa ciała wszystkich nagich myszy BALB/c wahała się wokół 20 g po leczeniu różnymi lekami. W dniu 22 masa ciała nagich myszy BALB/c w grupie cisplatyny znacznie się zmniejszyła, a masa ciała stopniowo zmniejszała się po zaprzestaniu wstrzyknięć do żyły ogonowej, wskazując, że wolna cisplatyna miała pewną toksyczność. Masa ciała nagich myszy BALB/c w grupach nanocząstek LPC i LPC-TCZ nie zmniejszyła się znacząco, wskazując, że nanocząstki mogły zmniejszyć toksyczność cisplatyny dla normalnych tkanek.

Czy TCZ zwiększa efektywność terapii poprzez modyfikację sygnałów komórkowych?

Wyniki badania przeszczepionego guza wykazały, że sam TCZ wykazywał pewne działanie przeciwnowotworowe, sugerując, że TCZ może hamować wzrost guza poprzez tłumienie szlaku sygnałowego IL-6, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami w literaturze. Jednak poprzedni eksperyment MTT wykazał, że TCZ nie mógł skutecznie hamować proliferacji komórek in vitro w zakresie stężeń 0,01–1 μM. Może to wynikać z faktu, że eksperymenty in vitro obejmowały tylko komórki nowotworowe, które wydzielały niewielką ilość IL-6; jednak w eksperymentach in vivo, ustanowiono model guza, a mezenchymalne komórki macierzyste, fibroblasty związane z guzem i makrofagi w mikrośrodowisku guza wydzielały IL-6, aby działać na komórki nowotworowe i promować ich proliferację.

Analiza barwienia immunofluorescencyjnego wykazała znaczną redukcję sygnalizacji EMT (N-kadheryny) i CSC NSCLC (oct-4) w modelu nagiej myszy A549/CDDP po leczeniu TCZ i LPC-TCZ. Jednakże wpływ TCZ na proliferację (Ki67) nie był wyraźny, wskazując, że TCZ odgrywał rolę w zwiększaniu działania cisplatyny i miał efekt mnożnikowy. Wyniki te wskazują, że LPC może wzmocnić hamowanie tworzenia CSC i proces AMT NSCLC poprzez połączenie z TCZ w modelu przeszczepienia guza u nagiej myszy.

Jakie perspektywy otwiera nowe podejście terapeutyczne?

Podsumowując, z powodzeniem przygotowano lipidowo-powlekane nanocząstki cisplatyny sprzężone z TCZ, które odwracały oporność na CDDP i hamowały przerzuty komórek nowotworowych poprzez hamowanie szlaku sygnałowego IL-6, zwiększając tym samym efekt terapeutyczny CDDP. Jednakże istnieją pewne ograniczenia w metodzie i treści tego badania. Po pierwsze, badanie to omawiało rolę TCZ tylko z perspektywy EMT i charakterystyki komórek macierzystych guza. Jednakże szlak sygnałowy IL-6 jest złożony, a jego dalsze szlaki sygnałowe obejmują również PI3K/AKT i MAPK, które są związane z opornością guza. Dodatkowo, IL-6 jest zaangażowana w wiele procesów rozwoju guza, takich jak aktywacja innych czynników onkogennych i promowanie angiogenezy. Czy TCZ może hamować te szlaki sygnałowe lub progresję guza wymaga dalszych badań. Po drugie, wskaźnik enkapsulacji CDDP wymaga poprawy, prawdopodobnie ze względu na fakt, że podczas przygotowywania nanocząstek CDDP powlekanych DOPA przy użyciu metody mikroemulsji odwróconej fazy, niektóre proleki cisplatyny reagują z KCl, tworząc osad CDDP, który nie jest powlekany przez DOPA. W konsekwencji, fosfolipidy nie mogą być powlekane w procesie hydratacji błony. Kolejnym krokiem jest optymalizacja procesu przygotowania nanocząstek w celu poprawy wskaźnika enkapsulacji CDDP, na przykład poprzez zwiększenie dawki DOPA lub zmianę stosunku fazy olejowej.

W tym badaniu naszym celem było opracowanie ukierunkowanej nanoplatformy do zwalczania oporności na cisplatynę w NSCLC poprzez modulację szlaku sygnałowego IL-6. W tym celu z powodzeniem zsyntetyzowaliśmy LPC-TCZ. Poprzez obszerne badania in vitro i in vivo wykazaliśmy, że LPC-TCZ skutecznie hamował wzrost guza, zmniejszał markery CSC, tłumił EMT i zwiększał wrażliwość na cisplatynę w opornych modelach NSCLC. Mechanistycznie, LPC-TCZ wywiera swoje efekty terapeutyczne poprzez blokowanie kaskady sygnałowej IL-6/gp130/JAK/STAT3, tym samym odwracając fenotypy EMT i CSC. Dodatkowo potwierdziliśmy zmienioną ekspresję białek związanych z EMT i CSC, w tym E-kadheryny, N-kadheryny, Snail, wimentyny, Oct-4 i Sox-2, w komórkach NSCLC opornych na cisplatynę. Łącznie nasze wyniki sugerują, że LPC-TCZ posiada znaczny potencjał jako strategia terapeutyczna o podwójnej funkcji, ukierunkowana zarówno na chemooporność, jak i przerzuty w NSCLC.

Nanoplatforma LPC-TCZ opracowana w tym badaniu wykazuje potencjał do przezwyciężenia oporności na cisplatynę i hamowania przerzutów w NSCLC. Jednakże jej długoterminowe bezpieczeństwo, farmakokinetyka i stabilność in vivo wymagają dalszych badań. Ponadto, heterogeniczność guza może wpływać na jej skuteczność u różnych pacjentów. Przyszłe badania będą miały na celu poprawę formulacji, testowanie jej w modelach pochodzących od pacjentów i eksplorację kombinacji z immunoterapią, aby wspierać translację kliniczną.

Podsumowanie

Przedstawione badania koncentrują się na innowacyjnym podejściu do leczenia opornego na cisplatynę niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) poprzez wykorzystanie nanopęcherzyków cisplatyny pokrytych lipidami i funkcjonalizowanych tocilizumabem (LPC-TCZ). System ten wykazuje skuteczność w przełamywaniu oporności na chemioterapię poprzez blokowanie szlaku sygnałowego IL-6/JAK/STAT3. Badania in vitro i in vivo potwierdziły, że LPC-TCZ efektywnie hamuje wzrost guza, zmniejsza ekspresję markerów komórek macierzystych nowotworu oraz hamuje przejście nabłonkowo-mezenchymalne. Nanoplatforma charakteryzuje się kontrolowanym uwalnianiem leku, dobrą stabilnością i zmniejszoną toksycznością w porównaniu do konwencjonalnej chemioterapii. W modelach zwierzęcych zaobserwowano 40,60% wskaźnik hamowania wzrostu guza przy zachowaniu lepszego profilu bezpieczeństwa. Wyniki sugerują, że LPC-TCZ może stanowić obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu opornego NSCLC, choć konieczne są dalsze badania nad długoterminowym bezpieczeństwem i skutecznością kliniczną.